豬鼻甲黏膜成纖維細(xì)胞PT-K75

細(xì)胞介紹

克隆Neuro-2A是由R.J.Klebe和F.H.Ruddle經(jīng)A株白鼠的自生腫瘤建立。該細(xì)胞產(chǎn)生大量微管蛋白，此蛋白在神經(jīng)細(xì)胞中起應(yīng)答軸漿流動的收縮系統(tǒng)作用。

細(xì)胞特性

1） 來源：腦神經(jīng)母細(xì)胞瘤

2） 形態(tài)：阿米巴樣干細(xì)胞

3） 含量：>1x10^6  細(xì)胞數(shù)

4） 規(guī)格：T25瓶或者1mL凍存管包裝

5)  用途：僅供科研使用。

凍存細(xì)胞的復(fù)蘇：：

將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL培養(yǎng)基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。然后將細(xì)胞懸液加入含6-8ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶（或皿）中37℃培養(yǎng)過夜。第二天顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況和細(xì)胞密度。

細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

對于貼壁細(xì)胞傳代可以參考以下方法：

棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細(xì)胞1-2次。

加入0.25％（w / v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培養(yǎng)瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養(yǎng)箱中消化1-2分鐘（難消化的細(xì)胞可以適當(dāng)延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng)瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養(yǎng)基來終止消化。

3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻。將細(xì)胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的培養(yǎng)基以保持細(xì)胞的生長活力，后續(xù)傳代根據(jù)實際情況按1:2~1:5的比例進(jìn)行。

3）細(xì)胞凍存: 收到細(xì)胞后建議在培養(yǎng)前3代時凍存一批細(xì)胞種子以備后續(xù)實驗使用。下面T25瓶為例；

1. 細(xì)胞凍存時按照細(xì)胞傳代的過程收集消化好的細(xì)胞到離心管中，可使用血球計數(shù)板計數(shù)，來決定細(xì)胞的凍存密度。一般細(xì)胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細(xì)胞/ml.

2. 1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細(xì)胞凍存液重懸細(xì)胞 ，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細(xì)胞/ml分配到一個凍存管中將細(xì)胞分配到凍存管中，標(biāo)注好名稱、代數(shù)、日期等信息。

3. 將要凍存的細(xì)胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉(zhuǎn)入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續(xù)查閱和使用。

細(xì)胞凋亡的早期形態(tài)學(xué)改變是核染色質(zhì)濃聚、固縮,聚集在核膜周邊，然后是胞漿濃縮、胞膜起泡,繼而細(xì)胞核裂解成若干碎片，細(xì)胞膜將胞質(zhì)和染色質(zhì)斷片包裹，胞漿內(nèi)形成多個膜結(jié)構(gòu)尚完整的“小泡"及 “凋亡小體" (apoptoticbody)。這不同于細(xì)胞壞死的細(xì)胞腫脹、胞膜破裂、細(xì)胞崩解。

       根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，至今為止，已經(jīng)設(shè)計了許多不同的細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測方法。

流式細(xì)胞技術(shù)

     流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞是通過檢查其光射特征及熒光參數(shù)時行的。細(xì)胞穿過流式細(xì)胞儀的激光束集點時使激光發(fā)生散射，分析散射光可以提供細(xì)胞大小及結(jié)構(gòu)的信息。散射光包括前向散射光和左向角散射光兩種，前向散射光的強度與細(xì)胞大小、體積相產(chǎn)，右向角射光的強度與細(xì)胞結(jié)構(gòu)的析射性、顆粒性（granu-larity）有關(guān)。

     細(xì)胞凋亡過程中出現(xiàn)的形態(tài)改變?nèi)缂?xì)胞皺縮、胞膜起泡、核濃縮和碎裂等可以使光散射特性發(fā)生改變。早期凋亡細(xì)胞主要表現(xiàn)為前向散射光減弱而右向角散射光增強或不變，前者反映了細(xì)胞的皺縮，后者反映了細(xì)胞的核逐縮及碎裂。晚期凋亡細(xì)胞的前向散射光和右向角散射光均減弱。

     由于光散射牧場生并非凋亡細(xì)胞的特異性指標(biāo)，細(xì)胞的機械性損傷和細(xì)胞壞死也可以使前向散射光減弱。因此，只有將光散射特性的檢測與熒光參數(shù)的檢測結(jié)合起來才能準(zhǔn)確地辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。

     細(xì)胞凋亡過程中核酸內(nèi)切酶在DNA分子核小體間的降解，導(dǎo)致小分子DNA漏出，核DNA含量下降，細(xì)胞熒光染色后作流式細(xì)胞儀分析，可以發(fā)現(xiàn)在DNA直方圖上正常二倍體細(xì)胞的Go/G1峰前出現(xiàn)一個亞二倍體峰（xub-G1峰，即AP峰--apoptotic peak）,代表凋亡細(xì)胞。

    根據(jù)此亞二倍體峰可以計算凋亡細(xì)胞的百分率。此外，流式細(xì)胞術(shù)還可以通過測定線粒體膜的電位、溶酶體質(zhì)子泵的活性及細(xì)胞DNA/總蛋白質(zhì)比例等方法辨認(rèn)凋亡細(xì)胞。

檢測方法：獲取密度1×106細(xì)胞/ml左右的細(xì)胞懸液，精洗，固定，熒光染料染色，上流式細(xì)胞儀分析。

豬鼻甲黏膜成纖維細(xì)胞PT-K75

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小鼠肝癌細(xì)胞 Hepa1-6

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小鼠乳腺癌細(xì)胞 4T1

小鼠胚胎瘤細(xì)胞 ATDC5

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小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞 GL261

小鼠肺癌細(xì)胞 LLC

小鼠骨肉瘤成骨細(xì)胞 K7M2wt

小鼠乳腺癌細(xì)胞 EMT6

小鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞 HT22

小鼠小腸內(nèi)分泌細(xì)胞系 STC-1

小鼠乳腺上皮細(xì)胞 EpH4-Ev

小鼠肝細(xì)胞 AML12

小鼠膀胱癌細(xì)胞 MB49

小鼠巨噬細(xì)胞 Ana-1

小鼠腎小球系膜細(xì)胞 SV40-MES-13

小鼠胚胎肝細(xì)胞 BNLCL.2

小鼠肥大細(xì)胞瘤細(xì)胞 P815

小鼠腎癌細(xì)胞 Renca

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小鼠骨髓瘤細(xì)胞 SP2/0

小鼠精原細(xì)胞系 GC-1spg

小鼠腎髓質(zhì)細(xì)胞 mIMCD-3

小鼠前列腺癌細(xì)胞 RM-1

小鼠宮頸癌細(xì)胞 U14

小鼠卵巢癌細(xì)胞 ID8

小鼠皮下結(jié)締組織細(xì)胞 L-WRN

小鼠胰腺腺泡癌細(xì)胞 266-6

小鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞　 OP9

小鼠胚胎成骨細(xì)胞前體細(xì)胞 MC3T3-E1

人子宮頸表皮癌細(xì)胞MS751 MS751

小鼠肝癌 H22

小鼠淋巴瘤細(xì)胞 EL4

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